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Il Cenacolo è parte del monastero delle Benedettine di Sant'Apollonia, il più grande monastero femminile di Firenze, fondato nel 1339. Dopo i lavoro promossi nel 1440 dalla badessa Cecilia Donati il cenacolo, un'ampia sala rettangolare con soffitto a cassettoni che fungeva da refettorio, fu affrescato su un'intera parete da Andrea del Castagno, nel 1447. Tutta la parte inferiore della parete è occupata dall'affresco dell’Ultima Cena: la scena si svolge in un ambiente riccamente decorato, dove ogni elemento architettonico è curato nel minimo dettaglio. L’impostazione prospettica è rigorosa, accentuata dall'effetto geometrico delle linee del pavimento e del soffitto. Al di sopra sono raffigurate la Resurrezione, la Crocefissione e la Deposizione nel sepolcro. Nel 1953 si effettuò il distacco di questa parte superiore per motivi di conservazione e furono trovate le sinopie (disegni preparatori), che sono esposte sulla parete opposta della sala. Nel Cenacolo sono conservati anche i pochi resti degli affreschi e delle sinopie delle Storie della Vergine un tempo nella chiesa di Sant'Egidio. Il ciclo pittorico, purtroppo in gran parte scomparso, è un’opera cardine del primo rinascimento fiorentino realizzata da Domenico Veneziano con l'aiuto di Alesso Baldovinetti, Piero della Francesca e dello stesso Andrea del Castagno. Sono esposte anche altre opere di Andrea del Castagno dipinte intorno alla metà del Quattrocento: una lunetta affrescata (e la sua sinopia) con il Cristo in pietà tra gli angeli, una Crocifissione e la sinopia della Visione di San Girolamo tra le Sante Paola e Eustachio. Sulla parete sud della sala si trova un Crocifisso attribuito a Baccio da Montelupo. Altre opere quattrocentesche provenienti dall'ex monastero sono esposte nell’antirefettorio: un affresco staccato con il tema della Crocifissione, opera di Paolo Schiavo, e due tavole di Neri di Bicci raffiguranti l’Incoronazione della Vergine e la Madonna col Bambino e santi. In quest’ultima tavola accanto alla Madonna compare Santa Apollonia nell'iconografia classica che la ritrae con un paio di tenaglie che stringono un dente, allusione alle torture subite durante il martirio.